[분자 생물학] Agarose gel extraction

안녕하세요~

 

이번 포스팅은 Agarose gel extraction입니다.

 

gel extraction은 왜 하는 것일까요??

 

그건 우리가 원하는 size band의 DNA fragment를 얻기 위해서 입니다.

 

예를 들어 vector를 enzyme cut 했을 때 잘린 fragment만 얻고 싶다면

 

agarose gel에 enzyme cut 한 sample을 electrophoresis 한 후 잘린 size의 linear fragment를 얻으면 됩니다.

 

잘리지 않은 vector는 enzyme cut 된 linear fragment 보다 훨씬 느리게 내려오기 때문에 enzyme cut 된 DNA fragment는 Agarose gel로 구분될 수 있습니다.

 

Agarose gel에서 확인된 DNA fragment를 쓰고 싶으면 Agarose gel에서 DNA fragment를 빼내야하기 때문에 추출(extraction)을 하는 것입니다.

 

Agarose gel extraction은 kit를 이용하면 편한데요,

 

아주 유명하면서 quality가 좋고 비싼 qiagen이 최곱니다..ㅎㅎ

 

우선 qiagen kit protocol은 간단합니다.

 

1. Agarose gel을 전기영동한 뒤 DNA transilluminator에서 size를 확인하고 DNA fragment를 얻습니다.

(항상 DNA work을 진행할 땐 최대한 깨끗한 상태로 작업을 하는게 좋습니다. 에탄올 소독한 장갑, 에탄올 소독한 칼, autoclave 된 tip과 ep tube)

 

**간혹 너무 큰 size의 DNA fragment 경우 정확한 size에 확인이 안될 수 있으니 너무 size에 연연하지 말고 실험 진행해도 괜찮습니다.

 

2. 자른 gel을 ep tube에 넣고 무게를 잽니다. 

(먼저 ep tube 무게를 재고 0점을 맞춰 자른 gel의 무게를 재면 됩니다. ; 보통 ep tube 무게는 1g 잘린 gel은 100~300g정도 입니다.)

 

3. gel 무게 3배만큼 volume의 QG buffer를 섞어줍니다.

 

4. heat block에서 56℃에서 10분간 incubating합니다. ( vortex하면서 하면 훨씬 빠르게 녹습니다. 대략 3분 안으로 녹는듯)

 

5. 다 녹은 것을 확인한 뒤 gel 무게 1배만큼의 iso-propanol을 넣고 vortexing해줍니다.

 

6. gel + QG buffer + iso propanol이 녹은 solution을 spin column centrifuge 해줍니다. 13000rpm, 1min, RT

 

7. wash buffer 넣고 centrifuge 해줍니다. 13000rpm, 1min, RT

 

8. 에탄올이 날아가도록 3분정도 뚜껑을 열어주거나 13000rpm, 3min 정도 더 돌려주면 에탄올이 다 날아갑니다.

 

9. elution 받을 ep tube에 spin column을 꽂고 elution은 DW로 진행하거나 EB buffer로 진행합니다. DW 또는 EB buffer 20ul를 spin column에 넣고 최소 1분 기다립니다. (너무 오래 기다리면 증발하니 1분 조금 넘으면 바로 centrifuge진행)

 

10. centrifuge 해줍니다. 10000rpm, 1min, RT (13000rpm으로 돌리다 보면 가끔 뚜껑이 부서질 때가 있음; 더 낮은 rpm에서 돌려도 됩니다. 8000rpm 정도?)

 

11. elution 된 용액의 농도를 잽니다.

 

protocol은 여기까지고 딱히 노하우랄 것도 없습니다.

 

주의할 것은

 

1. DNA work는 깨끗한 환경에서 진행할 것

2. gel을 자를 때 DNA transilluminator에서 최대한 UV를 적게 사용해서 자를 것 ( 너무 많은 UV 노출은 DNA mutation을 야기할 수 있음)

요즘은 UV 사용 안하고 blue light로도 관찰할 수 있는 것 같은데 저는 안써봐서 모르겠습니당

 

 

gel extraction은 저도 처음에 할 때 무서웠는데 한 번 해보고 나면 진짜 너무 간단한 작업입니다.

gel electrophoresis까지 하면 대략 1시간 조금 넘게 걸리는 것 같습니다.

 

DNA work 모두 어려워 하지말고 빠이팅 합시다~