[분자 생물학] Single-Directed Mutagenesis

안녕하세요 ~ 

 

이번 포스팅은 Single-Directed Mutagenesis입니다.

 

이 실험 방식은 Clone에서 우리가 원하는 부분을 바꾸거나 삽입, 제거가 가능한 방법입니다.

 

이 방식은 Primer Design을 통해 Vector의 Base를 바꾸는 방법인데 제 실험 경험상 최대 3bp 정도 변경, 삽입, 제거가 가능한 것 같습니다.

 

 

Primer를 이용한 Single-Directed Mutagenesis

 

Single-Directed Mutagenesis는 사실 Primer Design 만 하면 거의 끝났다고 보시면 됩니다.

 

그림에서 보시는 것처럼

 

1. Vector에서 바꾸고 싶은 곳을 선택 ( Template Strand 기준 'G' 선택 후 'T' 로 변경)

 

2. Forward Primer 기준으로 G와 붙는 부분을 'A'로 변경

**Primer는 일반적으로 72℃보다 낮은 온도여야하며 50~60℃ 정도 사이가 적당한 듯 함.

**일반적으로 Primer의 길이는 최소 15bp는 되야하고 Mutagenesis 시 약간 길어야 Efficiency가 좋음. 

 

3. Reverse Primer는 Forward Primer Design 후 Reverse Complement로 design한다.

ex) Forward Primer가 5'- ACGTGAGTGAGTGCGC-3'면 

      Reverse Primer는 5'GCGCACTCACTCACGT-3'이 맞음.

 

4.Primer 제작 후 Vector와 함게 PCR 진행.

 

5. PCR product를 E.coli에 Transformation하여 plate에서 하루 키움.

 

6. E.coli colony를 Inoculation 하여 mini prep 진행

 

7. mini prep 후 plasmid를 sequencing 하여 확인 !!

 

Single-Directed Mutagenesis는 제가 실험실에 들어가서 얼마 지나지 않아 배웠을 만큼 어렵지 않은 실험입니다.

 

이 실험은 Primer design만 잘해도 되고 design을 해주는 사이트도 많습니다.

 

오늘의 포스팅은 여기까지 하겠습니다~!@