안녕하세요!!
이번 포스팅은 western blot에서 Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)입니다.
protein lysate를 size 별로 구분하기 위해 SDS-PAGE를 진행합니다.
실험실마다 다르겠지만 저는 pre-made gel을 사용해서 아침에 gel을 만드는 일은 하지 않아서 굉장히 편했습니다.
gel을 직접 만드는 실험실 이야기를 들어보면 아침부터 gel 만들고 굉장히 바쁩니다.
그리고 Acrylamide가 사실 발암물질이라 건강에도 좋지 않아요 ㅠㅠ
(실험 많이 하고 짬이 좀 차다 보면 맨손으로 간혹 실험 material을 만지는 경우가 생기는데 굉장히 안 좋은 습관입니다.)
SDS-PAGE에 사용되는 gel은 크게 2 part로 나뉘는데
1) stacking gel 2) separating gel로 나뉩니다.
이 둘의 가장 큰 차이점은 gel의 조성인데 pH차이가 납니다.
stacking gel 안에는 Chloride ion과 glycine, protein lysate가 존재합니다.
amino acid는 아시다시피 작용기가 3개가 있는데 amine기, carboxyl기, amino acid마다 다른 R기가 있습니다.
이 3개의 작용기는 각각 Pka값이 다른데 amine기는 평균 pKa가 2.3 내외, carboxyl기는 평균 pKa가 9 내외입니다.
위 논문에서 정확한 pKa 값을 보실 수 있습니다.
glycine은 amino acid 중 가장 단순한 R기(-H)를 가지고 PI는 6 내외 입니다.
실험실이나 논문마다 pKa 값이 조금씩 달라서 PI 값이 정확하지는 않네요.
stacking gel은 pH 6.8이기 때문에 어쨌든 glycine은 약한 음전하를 띄게 됩니다.
위 그림처럼 electrophoresis는 (+) 방향을 향해 negative charge를 띄는 물질들이 이동하게 되는데
chloride - protein lysate - 음이온화 된 glycine 순서대로 움직입니다. (chloride가 가장 빠름)
gel에 sample loading을 하면 아무래도 처음에 높이가 있기 때문에 lysate를 최대한 동일 선상에서 출발할수가 없습니다.
하지만 stacking gel에서 lysate는 chloride, glycine 사이에 끼게 되어 압축된 상태로 이동하게 되고 lysate를 최대한 같은 선상에서 출발할 수 있게 해줍니다.
그림에서 보시는 것처럼 lysate는 stacking gel에서 말 그대로 stacking되어 separating gel 출발하기 전 같은 선상에서 분리될 수 있게 됩니다.
separating gel은 pH가 8.8이기 때문에 glycine의 대부분은 음전하를 띄게 됩니다. chloride와 glycine은 먼저 gel을 내려가고 separating gel에서 lysate는 거의 같은 선상에서 protein size별로 구분됩니다.
시간이 지남에 따라 protein은 separating됩니다.
PAGE 시 너무 오랫동안 gel을 내리다 보면 size가 작은 protein이 아예 젤을 빠져나갈 수도 있으니 주의해야합니다.
PAGE는 사실 protocol이라고 할 것도 없습니다.
----------protocol
1. Gel running 통에 gel을 넣고 buffer를 채웁니다.
2. protein sample을 loading 합니다.
3. 125V, 1hr 5 min 으로 PAGE를 진행합니다.
**develop 시 깔끔하게 band가 나오게 하는 법
1) protein sample loading volume을 줄인다.
stacking gel이 있긴 하지만 loading volume이 줄어들면 더 깔끔한 칼 밴드가 나옵니다.
2) loading하는 sample의 mass를 줄인다.
protein이 separating을 시작하면서 양이 너무 많으면 분리되는데 방해를 받습니다.
pre-made gel의 경우 well 당 mass capacity가 있으니 그 limit을 넘어도 protein separating에 좋지 않습니다.
3) loading tip을 사용한다.
gel에 protein sample loading 시 일반 tip과 loading tip을 사용해보면 바로 알 수 있습니다.
일반 tip중에 가장 작은 10ul tip을 사용해도 loading tip에 비해 두껍기 때문에 sample loading시 volume이 커보이는 효과를 보입니다.
loading tip을 사용하면 sample을 차곡차곡 잘 쌓을 수 있습니다.
4) PAGE 시 voltage를 낮춘다.
제가 사용했던 pre-made gel은 125V를 권장하지만 voltage를 좀 더 낮추면 더 깔끔하게 separating됩니다.
5) sample loading하는 well에 쌓여있는 불순물 제거하기
간혹 gel의 well에 acrylamide 찌꺼기가 껴있는 경우가 있는데 이런 건 buffer를 채운 뒤 pipette으로 well을 뾱뾱(?)해서 청소해주거나 DW가 차 있는 squeeze bottle로 제거해주는 것이 좋습니다.
SDS-PAGE 포스팅은 여기서 마치겠습니다~~!!
'Life Science Experiment' 카테고리의 다른 글
| [분자 생물학] Agarose gel extraction (0) | 2022.11.24 |
|---|---|
| [분자 생물학] Cloning - restriction enzyme (0) | 2022.11.22 |
| [분자 생물학] Western blot - Sampling (2) (0) | 2022.10.25 |
| [분자 생물학] Western Blot - Cell plating(1) (0) | 2022.10.17 |
| [분자 생물학] PCR (Polymerase Chain Reaction) (0) | 2022.10.14 |
