[분자 생물학] Western blot - Sampling (2)

안녕하세요~

 

이번 포스팅은 western blot에서 sampling에 관한 부분입니다.

 

cell plating 후 plasmid, siRNA, drug 처리 등 많은 조건을 바꿔가며 target protein의 정량적 변화 또는 signal의 변화 ( ex) phosphorylation ) 같이 protein level에서의 변화를 보기 위해 western blot을 진행합니다.

 

cell이 prep된 이후에 protein의 degradation을 막기 위해 protease inhibitor를 사용합니다.

그리고 protein의 phosphorylation은 phosphatase에 의해 제거되는데 phosphorylation여부를 보고싶다면 추가적으로 phosphatase inhibitor를 사용해야합니다.

출처 : Sigma-Aldrich

 

위 사진은 protease, phosphatase inhibitor의 종류들을 나열한 것입니다.

protease의 종류는 serine계, cysteine계, metalloprotease로 나뉩니다. 

aminopeptidase는 저도 처음 봤는데 위키피디아에서 보니 대부분이 metalloprotease라고 하네요!!

aminopeptidase는 N-term에서 substrate를 자르는 exopeptidase고 Carboxypeptidase가 C-term에서 amino acid를 자르는 exopeptidase라고 합니당

 

serine protease는 enzyme active site에서 tetrahydral intermediate를 만드는데 serine의 -OH기가 반응에 참여하는 경우에 해당하고 trypsin, chymotrypsin, elastase 같은 경우가 이에 해당합니다.

 

cysteine protease 역시 enzyme active site에서 -SH기가 반응에 참여하고 papain, calpain, TEV가 해당합니다.

 

metalloprotease는 enzyme activity에서 metal ion이 필요한 경우인데 보통 Zinc ion이 필요하나 간혹 Cobalt ion이 필요한 경우가 있습니다. ADAM family가 여기에 해당합니다.

 

phosphatase를 보기 전에

phosphorylation에 대해 간단히 보면 phosphorylation은 phospho group이 붙을 수 있는 serine, threonine, tyrosine에 가능합니다. 따라서 phosphatase의 substrate는 phospho-Ser, Thr, Tyr이 되겠네요.

참고로 p-Ser/p-Thr의 비율이 95%정도고 p-Tyr는 5%미만입니다.

 

phosphatase의  type은 tyrosine-specific / Serine,Threonine-specific / Dual Specific phosphatase로 나뉩니다. 아마 아미노산의 R기에서 큰 차이가 나서 이렇게 분류가 되지 않을까 싶네요.

 

사용 목적에 따라서 lysis buffer에 들어가는 inhibitor의 조성이 달라질 것 같습니다.

 

cell prep 후 lysis buffer에 cell lysate가 담겨 있더라도 cell의 완벽한 분해를 위해 추가적으로 sonication을 진행합니다.

 

lysis buffer에는 수많은 detergent들이 있지만 membrane-based organelle을 분해해야합니다.

 

sonication은 물리적으로 쉽게 부술수 있지만 열 발생이 있어서 sonication 후에 바로 ice에 박아줘야합니다.

 

protein work은 protein degradation 방지를 위해 항상 ice위에서 모든 것이 이루어지거나 차갑게 유지되는 조건에서 실험을 진행해야합니다. (기본상식)

 

protein prep과 lysis까지 진행이 되었으면 cell lysate는 DNA, RNA, protein, lipid 등 많은 물질들이 섞여있습니다. 

 

centrifugation을 통해 DNA, unlysed cell들을 제거하여 protein lysate할 수 있습니다. 

(nucleus membrane을 깨기 위해선 lysis buffer에서 detergent가 추가적으로 필요합니다)

 

Cell lysate를 centrifugation하면 pellet에 뭉쳐있는 DNA, unlysed cell을 제거 하고 supernatant만 prep합니다.

 

prep된 protein lysate는 정량을 한 후 sample buffer와 섞어서 sampling을 마무리 합니다.

 

 

Protein Quantification (단백 정량)

 

 

protein quantification에는 BCA, Bradford, nanodrop 등으로 할 수 있습니다.

 

BCA나 Bradford 둘 중 하나 고르라고 하면 저는 무조건 Bradford로 합니다.

 

BCA는 protocol 중에 30분간 incubation하는 과정이 있지만 Bradford는 vortexing만 하고 바로 96 well에 분주하여 정량이 가능합니다.

 

하지만 Bradford를 못쓰는 경우도 있습니다. Bradford는 anion detergent에 영향을 받기 때문에 일반적인 RIPA buffer같이 SDS가 많이 들어가는 경우 정량이 정확히 되지 않기 때문에 무조건 BCA로 해줘야합니다.

 

Bradford assay는 간단합니다.

 

ep tube에 1ml의 Bradford solution을 넣어주고 2ul의 protein lysate를 섞고 vortex 후 96 well plate에 200ul씩 분주하고 측정하면 끝입니다.

 

nano drop은 protein 흡광도가 높은 280nm에서 흡광하여 농도를 측정하는 방법입니다. 이 역시 간단한 방법인데 저는 사실 nanodrop으로 정량해본적이 없네요..ㅎㅎ

 

정량이 끝났다면 모든 sample을 정확한 양의 lysate를 ep tube에 분주하고 sample buffer와 섞어주어 vortexing 후 sampling을 마칩니다.

 

lysate의 양은 딱히 정해진건 없습니다.하지만 gel에 따라 정해진 최대치가 있긴합니다. 너무 많은 protein이 electrophoresis를 거치게 되면 정확한 separation이 어렵기 때문입니다.

 

보통 저같은 경우에 primary-Ab가 좋으면 20ug~30ug 정도 걸어줍니다.

 

 

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PAGE를 예쁘게 내리기 위한 방법들이 몇 가지가 있는데,

 

1. 낮은 sample volume ( + sample loading 시 낮고 평평하게 깔아줄 것)

2. electrophoresis 시 낮은 voltage

3. poly-acrylamide의 농도가 높은 gel을 사용할 것 

 

이렇게 있습니다. (PAGE 포스팅 시 자세하게 알려드립니다!)

 

sample volume이 높아지는 경우는 protein lysate 농도가 높아질 때입니다. 때문에 cell lysis시 너무 많은 lysis buffer volume은 western band를 두껍거나 드라큘라를 만들 수 있습니다.

 

드라큘라 모양 밴드는 너무 높은 voltage로 전기영동하거나 gel에 protein 샘플을 대충 깔면 나오는 것 같더라구요. 일반 팁 말고 무조건 loading tip으로 gel loading을 하시기 바랍니다.

 

western은 하면서 노하우가 조금씩 쌓이는 것 같습니다.

 

protein sampling Protocol

 

material - 2X sample buffer, protein lysate

 

0. 대부분의 protein work은 ice위에서 작업하고 PBS나 lysis buffer는 차갑게 유지해둔다.

 

1. ice 위에 plate를 두고 media aspirate

 

2. well 당 PBS 2ml을 넣어주고 wash ( pipet aid 사용)

 

3. lysis buffer 100ul 넣어주고 scraper로 최대한 모든 cell을 ep tube에 prep

 

4. sonication ( amplitude - 20%, time 20s) 

 

5. centrifugation - 13000rpm, 20 mins 

 

6. 새로운 ep tube에 centri한 sample sup만 prep, pellet은 버림

 

7. Bradford solution 1ml 씩 분주,  BSA를 이용하여 protein concentration curve 그리는 것 포함해야함.

 

8. Bradford assay 진행하여 농도 측정

 

9. 샘플마다 20ug로 정량하고 동일 volume의 sample buffer를 섞어줌.

 

10. heat block에서 80℃, 2분 동안 sample을 넣어줌. ( protein denaturation)

 

11. centrifugation 13000rpm, 1min 후 sample loading 준비

 

 

Western blot sampling 포스팅은 여기서 마무리하겠습니다~

 

다음 포스팅은 Western blot SDS-PAGE입니다!!