[분자 생물학] PCR (Polymerase Chain Reaction)

 

안녕하세요~

 

이번 포스팅은 PCR (Polymerase Chain Reaction) 입니다.

 

바이오 관련 전공이면 누구나 배우고 당연히 알아야할 실험 방법이죠.

 

서론 (TMI충 등장)

 

우선 PCR은 왜 하는 걸까요??

 

우리가 원하는 gDNA, pDNA 같은 original DNA에서 원하는 부분을 증폭 (amplication)하기 위해서 입니다.

 

중심원리 (central dogma)라고 다들 아실겁니다.

 

DNA --> RNA --> protein 순으로 DNA의 정보가 protein으로 순차적으로 전달되는 과정입니다.

 

DNA-->DNA 복제를 replication이라고 하고 우리는 PCR을 통해 replication이 가능하죠

 

반대로 RNA-->DNA로도 복제가 가능한데 이건 역전사(retro-transcript)라고 합니다. 

 

역전사 역시 실험으로도 가능하고 Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) 이라고 합니다.

 

그리고 Real-Time PCR 또는 Real-Time quantitative PCR (RT-qPCR) 실험 기법도 있습니다. 

 

RT-PCR은 다음에 포스팅하기로 하고 다시 PCR로 돌아오겠습니다.

 

PCR은 3가지 step이 있습니다.

 

Denaturation - Annealing - Extension

 

Denaturation은 2가닥의 DNA를 서로 분리시키는 과정입니다. 

 

일반적으로 세포에서는 Helicase에 의해 높지 않은 온도에서 DNA 가닥의 분리가 가능하지만 vitro condition에서는 물리적인 방법으로 DNA를 분리시켜야하기 때문에 95℃의 고온에서 DNA의 수소결합을 분리시킵니다.

 

Annealing은 우리가 원하는 부분의 DNA에 primer가 붙는 과정입니다.

 

primer는 실험자가 원하는 부분을 디자인한 DNA oligomer입니다.

 

보통 20mer 전후로 짜여집니다. primer의 nucleotide number, GC contents에 따라 primer의 melting temperature(Tm) 값이 달라지는데 Tm은 55~70℃ 사이로 디자인하는게 일반적입니다.

 

Annealing temperature는 일반적으로 Tm -(2~6)℃로 설정하여 PCR을 진행합니다.

 

마지막으로

 

Extension은 72℃의 온도에서 polymerase가 primer가 붙은 부분을 증폭시키는 과정입니다.

 

PCR step 중 time-temperature 그래프

위 그림은 많이 보셨겠지만 PCR을 진행하면 위와 같은 3 step으로 온도를 변경해가며 replication을 진행합니다.

 

cycle을 1번 돌면 DNA 양이 2배, 2번 돌면 4배 증가합니다.

예를 들어 original DNA의 양이 A라면 cycle 1번 돌았을 때 총 DNA 양은 2A입니다.

cycle을 n번 돌았을 때 총 DNA 양은 당연히 2^n*A, 그리고 PCR product의 양은 (2^n-1)*A이 됩니다.

 

아래 그림은 PCR cycle에 따른 DNA product 그림입니다.

original의 양은 그대로이고 우리가 원하는 부분만 증폭되는 것을 확인할 수 있습니다.

 

 

 

DNA replication은 당연히 DNA polymerase가 필요합니다.

 

Enzyme 특성상 적정 pH, 온도가 중요한데 72도에서 replication을 진행하려면 고온에서도 변성이 없는 polymerase를 사용해야하기 때문에

 

Thermus aquaticus (Taq)에서 추출한 polymerase와 Pyrococcus furiosus (Pfu)에서 추출한 polymerase가 주로 사용됩니다.

 

참고로 둘 다 호열성 균이기 때문에 Archaea로 생각되지만 Taq은 bacteria에 속하고 Pfu는 Archaea에 속한답니다.

 

실제 실험에서는 쓰이는 용도가 다른데 단순히 DNA amplication을 확인하기위한 용도로는 Taq을 써도 무방하지만 일반적인 Cloning에서는 Pfu pol을 사용합니다.

 

**TA cloning의 경우 Taq을 사용하기는 합니다. Taq polymerase의 특징은 replication product 3' 끝에 A(아데닌)가 하나 더 붙는다는 것입니다. 때문에 양끝 말단에 A가 붙어서 vector에 T말단을 만들어 annealing 시켜 cloning을 진행합니다.)

 

Pfu polymerase는 3'->5' exonuclease proofreading 기능이 있고 Taq은 없기 때문에 일반적인 cloning에서는 Pfu pol을 사용합니다.

 

DNA pol은 replication 중 nucleotide를 잘못껴넣어서 error가 발생하는데 3'->5' exonuclease activity에 유무에 따라 Taq pol의 error rate는 pfu pol error rate보다 대략 10배정도 높습니다. 그래서 pfu pol이 high fidelity를 갖는다고 합니다.

 

오늘은 PCR에 관해 포스팅하려다보니 TMI만 방출해버렸네요..;;

 

나중에 cloning과 관련된 포스팅을 하면서 protocol 정리를 하겠습니다..!!