[분자 생물학] Lenti Virus

안녕하세요~ 이번에 포스팅할 내용은 Lenti virus 입니다.

 

Lenti Virus는 실험실에서 굉장히 많이 사용하는 virus 죠!

 

보통 Knock Out, Knock Down, Overexpression에 다 사용합니다.

 

Lenti Virus는 Retrovirus로 RNA를 유전물질로 가지는 virus 입니다.

 

Retrovirus는 특성상 replication 시 host cell에 Reverse transcriptase를 이용하여 본인의 gene을 insertion 하는 특성이 있죠!!

 

이 특성을 이용해서 우리는 실험실에서 gene vector로써 이용합니다.

 

Retrovirus가 만들어지기 위해 꼭 필요한 gene 구성 3가지가 있죠~

 

gag, pol, env 입니다.

 

gag는 group specific antigen들을 포함하는데 Viral matrix (MA), Capsid (CA), Nucleoprotein (NC)를 포함합니다.

 

pol은 Reverse transcriptase이고

 

env은 virus surface에 박혀있는 glycoprotein입니다. (transmembrane protein)

 

Lenti Virus를 만들기 위해 요 3가지가 들어있는 vector를 이용해서 virus를 제작하면 되겠죠 ??

 

gag, pol, env이 하나의 clone에 들어있으면 편리하겠지만 이 3가지가 동시에 존재하는 vector가 어느 cell이나 실험자에게 contamination이 일어날 경우 위험하기 때문에 요 3개의 factor를 하나의 vector에 담지는 않습니다.

 

현재 lentivirus를 만드는 generation은 2nd, 3rd generation인데요, 아마 예전에는 하나의 vector에 담았던 것 같기도 합니다. (아마 제 추측으로는 수십년 전만해도 transfection efficiency도 떨어지고 cloning도 어려운 일이라 하나의 vector에 담았던 것 같기도 합니다..!!)

 

제가 사용했던 방식은 2nd generation인데요,

 

Lentivirus를 만드는데 필요한 vector는 MD2.G, psPAX2입니다.

MD2.G의 vector map (출처 : Addgene)

psPAX2의 Vector map (출처 : Addgene)

MD2.G Clone에는 env에 해당하는 gene이 들어있고 psPAX2에는 gag, pol 이 발현됩니다.

 

MD2.G에서 발현되는 env은 VSV-G(vesicular stomatitis virus-glycoprotein)이고 

psPAX2에서 발현되는 gag, pol은 HIV에서 가져온 gene입니다.

 

MD2.G는 size가 5.8kb이고 psPAX2는 10.7kb입니다.

 

요 2개의 clone을 MD2.G, psPAX2 = 1:3의 비율로 transfection 시켜주면 Lentivirus 제작이 됩니다.

(우리가 원하는 insertion gene을 포함한 vector도 넣어줘야하지만 추후에 포스팅 하겠습니다~!)

 

Lentivirus는 보통 transfection은 293T cell에서 진행합니다. (transfection efficiency가 높음)

 

그리고 획득한 virus는 48 시간 이후 prep하고 centrifuge 후 0.45um filter를 거친 후 사용해야합니다.

(0.22um를 사용할 경우 virus particle에 손상이 갈 수도 있음. 해도 되긴됨. 저는 그냥 0.22um 썼어요..ㅎㅎ)

 

host cell인 293T가 어쩌다가 딸려와서 나중에 transduction할 cell에 같이 섞이면 그 cell 못씁니다..ㅎㅎ

이 부분 꼭 주의 ~!@

 

얼린 Lentivirus는 냉장 1주일, deep freezer 6개월 정도로 유통기한 생각하고 쓰시면 됩니다.

 

deep에 있는 건 좀 오래 둬서 써도 되긴하는데 그래도 나중에 transduction이 잘 안될 수도 있습니다.

 

Virus가 아무리 생명력이 질기다고 해도 실험 결과가 비슷하게 나오려면 fresh한 Virus가 좋겠죠??

 

Lentivirus 정말 값싸고 유익한 친구같습니다!! 하지만 virus prep 시 syringe와 needle을 사용하기 때문에 찔리지 않게 꼭!꼭! 조심해서 사용해야합니다!!