[분자 생물학] Gibson Assembly의 원리

안녕하세요~

 

Gibson assembly 포스팅을 하고 너무 길어져서 원리만 따로 빼서 포스팅합니다~

 

사실 뭐.. 원리라고 할 건 없긴한데요

 

Gibson assembly kit나 master mix를 구매하시면 mix vial에 여러가지가 섞여있습니다.

 

master mix에 섞여 있는 것 중에 핵심은 5'-exonuclease, polymerase와 ligase입니다.

 

저도 대략적으로 찾아봤는데요, 검색을 해보니 5'-exonuclease는 아마도 T5 exonuclease인 것 같습니다. 

(제가 알기로 master mix는 5'-exonuclease라고만 설명이 되어있습니다.)

출처 : New England Biolabs

 

5'-exonuclease도 여러가지겠지만 Lambda exonuclease도 있습니다.

 

출처 : New England Biolabs

NEB에 검색하시면 보통 enzyme에 관한 설명들이 있습니다.

 

두 그림을 보고 T5 exonuclease와 Lambda exonuclease 차이를 아시겠나요??

 

맞습니다.

 

두 enzyme은 function은 DNA 바깥쪽에서부터 DNA를 dNMP로 분해하는 것이 맞지만 작용하는 substrate가 다릅니다.

 

T5는 non-phosphorylation DNA를 인식하여 자르고 Lambda exonuclease는 phosphorylation DNA를 인식하여 자릅니다.

 

보통 primer는 5'-phosphorylation modification을 하지 않는 이상 5' 말단에는 phosphorylation이 되어있지 않습니다.

 

그래서 아마도 T5 exonuclease같은 enzyme을 사용했을 것 같네요.

 

자! 이제, Gibson assembly의 concept입니다.

 

PCR product는 blunt end지만 겹치는 부분이 5'-nuclease에 의해 잘리면서 sticky end처럼 만들어집니다.

5'-exonuclease에 의해 blunt end --> sticky end로 바뀜

vector와 insert 가 위와 같이 sticky end로 바뀌면서 서로 겹치는 부분이 annealing됩니다.

 

그러면 빈 부분은 polymerase가 채워주고 ligation에 의해 nick이 채워집니다.

 

Gibson concept을 이해하셨다면 왜 primer를 이용해 겹치는 부분을 만드는지 이해가 되실겁니다.

 

Gibson 만만세입니다..!!