[분자 생물학] Isosbestic point (등흡광점)

안녕하세요~ 이번에 포스팅할 내용은 Isosbestic point (등흡광점) 입니다~!

 

모든 물질들은 빛을 받으면 흡수 (absoprtion)하여 흥분 (excitation)상태가 된 후 다시 방출(emission)하는데요,

 

형광물질을 이용해서 분자생물학에 적용할 수 있습니다.

 

형광물질을 이용한 실험에는 IF가 있지만 pH나 이온의 농도도 측정이 가능합니다.

 

pH의 경우 BCECF, Ca2+의 경우 fura-2를 이용합니다.

 

BCECF나 fura-2의 경우 cell에 어느정도 확산 시켜 들어가게 한 후 imaging을 해야하는데 어떤 세포는 형광 dye가 많이 들어가고 어떤 세포는 적게 들어가는 경우가 생길 수 가 있죠 ??

 

그런 것을 보정하기 위해 Isosbestic point가 사용됩니다.

 

Isobestic point

BCECF는 pH에 따라 excitation wavelength와 intensity가 다르게 나오는데 위 그림은 그에 대한 그래프입니다.

(출처 : [논문] Measurement of intracellular pH)

 

BCECF의 경우 약 530nm의 빛을 쏴주면 450nm에서 거의 excitation intensity가 pH마다 거의 똑같은 것을 확인할 수 있죠?? 이것을 우리는 isobestic point라고 합니다.

 

논문의 표현에 따르면 pH-insentive 라고 표현하기도 하네요.

 

반대로 505nm에서는 excitation이 가장 많이 차이 나므로 BCECF는 505nm의 excitation을 측정을 하고 pH-sensitive라고 표현을 합니다.

 

우리는 그래서 어떤 시료가 있으면 535nm의 wavelength를 쏴줍니다. 그리고 2가지 450, 505nm의 파장을 둘 다 detection을 하는거죠.

 

그렇다면 동일 시료 기준 pH가 6.7이든 7.5든 8.0이든 어떤 pH에서도 450nm의 excitation은 같고 505nm의 값만 변하게 됩니다. 

 

그래서 pH를 측정할 때 excitation of 505nm / excitation of 450nm의 ratio를 측정해서 비교하는게 가장 정확합니다.

 

cell이 너무 크고 dye loading을 많이 해서  bcecf가 많이 들어갔다고 하면 505nm 값이 크겠지만 450nm 값 역시 동일하게 커지기 때문에 ratio로 보는게 정확한 겁니다.

 

비슷한 예로 들자면 western blot에서 house keeping gene으로 보정을 하는 것처럼 imaging 실험도 보정을 통해 좀 더 정교한 data를 얻는다고 생각하시면 편합니다!!

 

pH indicator인 BCECF로 등흡광점을 설명해 봤는데요, 궁금한 부분이 있으면 댓글로 남겨주세요~!@

 

이번 포스팅은 여기서 마치겠습니다!!