[분자 생물학] Western Blot - Cell plating(1)
안녕하세요
이번 포스팅은 Western Blot입니다.
서론
Western blot은 내용이 많을 것 같아서 나눠야 할 것 같습니다.
Western blot을 나눠보면
순서대로
1. Cell plating
2. Sampling
3. PAGE
4. Transfer
5. Develop
으로 될 것 같습니다.
저는 주로 cell을 기반으로 실험을 했기 때문에 cell 위주로 포스팅하겠습니다.
western blot을 하는 이유는 protein의 detection을 하는데에 목적이 있습니다.
Electrophoresis를 통해 protein을 size별로 구분하고 membrane으로 transfer하여 원하는 protein target을 antibody를 통해 detection하게 되죠.
대조군과 실험군에서 protein level의 차이가 얼마나 나는지 western blot을 통해 알 수 있습니다.
cell plating은 dish나 6well 같은 plate에 seeding하는 것을 의미합니다.
cell plating할 때 cell density가 중요한데요,
너무 적은 양의 cell을 seeding하게 되면 cell proliferation이 느려질 수 있고 western하기에 충분한 양의 protein을 얻지 못할 수 있습니다. 특히 transfection을 할 때에 적당한 cell density가 필요합니다.
너무 많은 양의 cell을 seeding하게 되면 transfection efficiency가 낮아질 수 있습니다.
실험을 들어갈 때 cell plating 조건을 잡아두고 실험을 진행해야 나중에 재현성이 높아진답니다.
일반적으로 plate 종류마다 cell plating density가 달라지는데 아래 표처럼 일반적인 조건들은 이미 잡혀있습니다.
Protocol (HEK293 cell 기준 6well에 seeding 가정)
1. Dish에서 키우던 cell의 media를 suction 후 warming된 Trypsin-EDTA를 처리하고 3분 동안 37℃ ,CO2 5% incubating
2. Cell detach된 것 확인하고 떨어지지 않았다면 gentle하게 dish를 tapping하여 떼어낸다. 너무 많이 붙어있으면 추가적으로 incubating한다.
3. 3ml의 media를 dish에 부어준 후 cell을 prep하여 15ml conical tube에 모은다,
4. 1000rpm, 2분 centrifuge
5. media제거 후 media 5ml을 넣어서 resuspension
6. ep tube에 trypan blue 20ul, resuspension한 cell 20ul를 넣고 pipetting
7. counting slide에 10ul를 넣어준다.
8. counting
9. counting 후 0.3x10^6 cells만큼 well에 seeding한다.
10. plate를 위아래, 좌우로 천천히 흔들어준다.
* 너무 빠르게 흔들면 가운데로 몰릴 수 있음. even하게 깔리게 하는게 가장 중요!!
11. 37℃ ,CO2 5% incubating
cell seeding은 사실 어려운 부분이 아니긴합니다만 plating도 쉬운 cell line이 있고 어려운 cell line이 있습니다.
보통 plating이 쉬운 경우는 plate에 굉장히 attach를 잘하는 경우거나 잘 자라는 경우입니다.
하지만 HEK293 같은 cell은 attach하는 힘이 약해서 나중에 PBS wash에도 cell이 떨어지는 경우가 있어서 추가적으로 plate에 coating을 해주는데요!!
저는 주로 poly-D-lysine을 사용했습니다.
cell은 보통 (-) charge를 띄기 때문에 (+) charge를 띄는 poly-D-lysine을 coating해주면 plate에 엄청 잘 붙습니다.
poly-D-lysine coating protocol (6well 기준)
1. 6well 에 poly-D-lysine 1ml을 처리한다.
2. 30분간 RT incubation
3. poly-D-lysine을 다시 회수하고 DW 2ml을 넣어서 2번 wash한다.
4. DW를 suction하고 완전한 건조를 위해 plate를 기울여두었다가 고인 DW를 마지막으로 한 번 더 suction하여 처리한다.
단순 attach가 약한 경우 poly-D-lysine을 처리하기도 하지만 어떤 cell 들은 다른 coating이 필요한 경우도 있습니다.
특히 primary cell같은 경우 culture를 위해 ECM (extracellular matrix)가 필요한 경우가 있습니다.
예를 들어 collagen coating이 필요한 경우가 있습니다.
collagen coating도 위와 같이 진행합니다.
cell plating은 아마 실험실마다, 실험마다 항상 달라집니다.
vitro 실험에서 가장 처음으로 진행하는 단계이고 쉽지만 중요한 단계입니다.
cell의 관리를 항상 최상으로 유지하려고 해야 올바른 실험결과와 재현성이 높아지게 됩니다.
cell plating 포스팅은 여기서 마치겠습니다!!