[분자 생물학] Cell culture
안녕하세요~
오늘은 Cell culture (세포 배양)에 관해 포스팅 해보려고 합니다.
서론 (주저리주저리) - 급하신 분들은 밑에 protocol 참고하세요!!
세포는 기본적으로 분열을 합니다. 라고 말하면 이건 100% 맞는 말은 아니죠?
분열하지 않는 세포들도 있고 분열을 자주하는 세포도 있죠.
대표적으로 분열하지 않는 세포는 뉴런이 있겠네요.
이런 세포들은 세포주기 G0기에 머물러있습니다. 보통 이런 세포들은 분화가 끝났기 때문에 더 이상 분열하지 않습니다.
분열하지 않는 세포 중 또 한 가지는 노화(scenesence)된 세포입니다.
scenesence란 분열(division)이 멈춘 세포를 의미하죠. scenesence에 관한 내용은 나중에 다시 포스팅하기로 하겠습니다.
세포 배양은 분열을 하는 세포들을 위해 합니다.
대표적으로 cell line이 있습니다.
cell line은 일반적으로 immortalized된 세포주들을 의미합니다.
immortalized된 세포들은 일반적으로 분열을 멈추지 않기 때문에 계대배양(sub-culture)를 해줘야합니다.
인위적으로 proliferation을 계속하게 만든, engineering된 세포주들도 있지만 대부분의 cell line은 human에서 채취된 cancer cell들입니다.
그래서 대부분의 cell line들은 human organ마다 대부분 있다고 보면 됩니다.
ATCC(American Type Culture Collection) (https://www.atcc.org/)
위 사이트에서 cell line에 대한 정보들을 얻으실 수 있습니다.
Cell culture protocol
서론이 너무 길었네요..!!
제가 원래 말이 많고 TMI가 긴 편이라 이해부탁드립니다..ㅠㅠ
protocol은 간단 명료하게 정리해보겠습니다.
Material
DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)
FBS (Fetal Bovine Serum)
Penicillin + Streptomycin (P/S)
(DMEM + FBS 10% + P/S 1% 섞어서 사용)
Trypsin-EDTA 0.05%
75T Flask
15ml conical tube
pasteur pipette
200ul tips
10ml pipette aid tips
70% alcohol
cell line (HEK293)
Equipment
Clean bench + suction pump
centrifuge
water bath
pipette aid
incubator ( 37도, CO2 5%)
Protocol
세포 배양하기 전 DMEM, Trypsin-EDTA는 미리 water bath에서 warming해야합니다.
1. Clean bench를 70% alcohol로 소독한다.
2. HEK293이 있는 75T flask의 media를 clean bench의 suction pump를 이용하여 제거한다.
- pasteur pipette은 suction pump의 고무관에 연결되어 사용됩니다
3. pipette aid를 이용하여 Trypsin-EDTA 0.05% 3ml을 media가 제거된 75T flask에 벽면을 따라 넣어준다.
- 세포에 직접 Trypsin-EDTA나 media를 부어주는 것은 cell에 mechanical stress를 주거나 세포의 detach를 유발하기 때문에 벽면을 따라 넣어주는 것이 좋습니다.
4. 3분 동안 37도씨 incubator에서 반응시킨다.
5. 3분 후 세포가 완전히 바닥에서 떨어졌는지 확인하고 덜 떨어졌으면 추가적으로 incubator에서 반응시키거나 tapping을 하여 세포를 떨어뜨린다.
- 세포에 trypsin 처리 시간은 너무 길면 세포에 좋지 않습니다.
- tapping을 너무 세게 하면 cell에 stress가 가해져서 좋지 않습니다.
6. 떨어진 세포가 있는 75T flask에 DMEM 3ml을 넣고 세포들을 모두 15ml conical tube에 회수합니다.
7. 1000rpm, 3분 동안 세포를 침전시킵니다. (기기마다 rpm - rcf 값은 다릅니다.)
- 너무 빠른 속도로 원심분리하면 세포 다 터집니다..!!
8. 원심분리하는 동안 새로운 75T flask에 cell line 정보를 써주고 8~10ml의 media를 넣어둡니다.
8. 15ml conical tube를 벤치로 가져와서 알코올로 소독합니다.
9. 상층부의 trypsin + DMEM을 제거합니다.
10. pipette aid를 이용하여 DMEM 5ml을 conical tube에 넣고 resuspension 합니다. (뭉친 세포를 풀어줍니다.)
11. 세포마다 배양하는 세포의 수는 각각 다른데 HEK293 cell line의 경우 75T flask에 1 x 10^6 cells 정도 깔아줍니다.
- 특정 세포들은 seeding 해주는 cell count에 따라 proliferation이 빨라지거나 느려질 수 있습니다.
12.골고루 퍼지게 상하, 좌우로 흔들어준 뒤 incubator에 넣어줍니다.
13. 3일마다 한 번씩 sub-culture를 계속 이어가줍니다.
세포 배양에 관한 포스팅은 여기까지입니다.
이것도 나름대로 간추린 내용인데 내용이 너무 많아졌네요 ㅠㅠ
혹시 궁금한 점이 있으시면 댓글 남겨주시길 바랍니다!!