[분자 생물학] Western blot - Trasnfer (4)
안녕하세요~
이번 포스팅은 Western blot에서 Transfer 입니다.
Transfer는 SDS-PAGE를 통해 PolyAcrylamide gel에 존재하는 Protein을 membrane으로 옮기는 과정입니다.
membrane으로 왜 옮길까요??
Cell을 Lysis하게되면 Cell에서 Expression 되는 수 많은 단백들이 존재하는데 우리가 원하는 Protein은 PolyAcrylamide gel 사이 어딘가에 위치하고 있습니다.
우리가 원하는 Protein을 Detection하기 위해선 membrane으로 옮기는 과정이 필요합니다.
membrane에는 대표적으로 쓰이는 것은 Nitrocellulose와 PVDF(PolyVinylidene DiFluoride)입니다.
Nitrocellulose와 PVDF는 Protein을 capture할 수 있지만 목적에 따라서 membrane을 선택할 수 있습니다.
Cytiva 社의 Site에서 제공한 표입니다.
Nitrocellulose와 PVDF에 차이가 있는데 이 부분에 대해서는 나중에 다시 포스팅 해보겠습니다...!!
Transfer를 하기 위해 membrane을 골랐다면 wet, semi-dry, dry 방식으로 또 나뉘는데요
wet 방식은 기존의 방식이고 semi-dry, dry는 조금 더 최근에 이용되는 Tool 입니다.
저는 wet(습식)과 semi-dry(세미-드라이)를 사용해봤습니다.
전체적으로 원리는 비슷하나 사용되는 버퍼의 양과 시간이 차이가 난다고 볼 수 있습니다.
wet 방식이 efficiency는 가장 좋지만 보통 1시간 30분 ~2시간 정도의 시간이 걸리고 semi-dry는 10분 안으로 끝나기 때문에 각각의 장단점이 있습니다.
저는 wet 방식을 훨씬 많이 써봐서 wet 방식에 대해 포스팅 하겠습니다.
Transfer 하는 단계는 SDS-PAGE 후의 단계인데요,
Transfer는 Casstte에 membrane, gel을 결합한 채 진행됩니다.
위 그림은 casstte에 gel과 membrane이 어떤 순서로 쌓여야하는지 보여줍니다.
gel에 존재하는 protein들은 SDS와 함께 붙어있기 때문에 (-) 극을 띄게 됩니다.
Transfer는 전류를 흘려 이동시키기 때문에 protein은 (-) 에서 (+) 극으로 이동하게 됩니다.
그림에서 protein이 이동하는 방향은 아래에서 위가 되기 때문에 gel 위에 membrane이 존재하게 되는 겁니다.
(참고로 sponge pad는 굳이 없어도 되지만 casstte 안의 gel과 membrane이 tight하게 묶이게 하는 역할을 합니다.)
카세트 결합을 하고 transfer 기계에서 run을 진행하면 됩니다. wet 방식은 lab 마다도 transfer run 조건이 다르기 때문에 무엇이 맞다고 하기는 어렵습니다. 저는 보통 1시간 15분에서 1시간 30분 정도 진행을 했고 electric current(전류) constant로 진행했습니다. voltage constant로 하지 않는 이유는 transfer buffer의 온도가 달라지면 resistance 값도 달라지기 때문에 voltage와 electric current가 바뀝기 때문입니다.
voltage constant로 진행할 경우 Transfer Buffer의 온도가 계속 바뀌고 전류도 계속 바뀌기 때문에 적정한 voltage를 실험 조건으로 잡기 까다롭습니다.
electric current constant가 상대적으로 조건 잡기 쉬운 것 같긴 하지만 실험 조건 잡는 것은 사람마다, 랩마다 다릅니다.
각자 원하는 target에 맞는 조건을 잡으면 됩니다. 100% 뭐가 맞다? 없습니다 !
wet 방식은 오랜시간 동안 진행되기 때문에 Buffer를 냉각시키고 추가적으로 ice pack이 필요합니다. (열이 굉장히 많이 발생함) 열이 많이 발생하면 membrane과 gel이 달라붙는다는 문제점이 생깁니다.
membrane에 gel이 붙는다면 수작업으로 다 떼어줘야하고 다 떼어지지도 않을 뿐더러 membrane에 손상이 가기 때문에 좋지 않습니다. 때문에 Buffer의 냉각과 ice pack의 준비 + transfer의 적절한 시간 조건 잡기가 중요합니다.
Transfer Buffer의 조성은 일반적으로 25mM Tris, 192 mM Glycine, pH 8.3 (Towbin buffer)의 조성을 가집니다.
거기에 20% methanol (v/v)을 포함합니다.
여기서 methanol의 역할은 gel에 존재하는 protein이 membrane으로 넘어가면서 잘 붙게 하기 위함입니다.
(gel의 swelling을 방지하는 역할도 한다고 함.)
transfer가 끝나면 이제 blocking, primary antibody, second antibody, develop만 남았습니다.
저는 Western blot을 routine하게 했었는데 고전적이면서도 중요한 실험인 것 같네요.
Transfer에 대한 포스팅은 여기서 마치겠습니다~!